【科技】Cell子刊：噬菌体对肠道菌群和代谢组的调控（三）
本文承接前面的两篇文章：
4 噬菌体靶向细菌缺失实验描述了细菌相互作用的因果效应
Dropout Experiments of Bacteria Targeted by Phages Delineate Causal Effects of Bacterial Interactions
通过比较有靶向噬菌体施加和没有靶向噬菌体施加的细菌定殖情况，我们揭示了噬菌体对周围微生态（surrounding microbiota）可量化的影响。如图3A中概念性地提出的，比较物种1存在时的细菌集合(完整联盟，full consortium)和物种1不存在时的细菌集合(细菌缺失，Bacterial dropout)，可以洞察其对周围微生态的促进和抑制作用；噬菌体捕食导致更大程度的细菌敲低（knockdown），其效果接近细菌缺失（dropout）。为此，选用九中细菌定殖无菌小鼠，并且依次缺失每种噬菌体的靶向细菌(图3B)。如图3C所示，尽管在定殖过程中总体平均细菌密度相似，但每一组小鼠都显示出显著的组成差异: 整体群落 = 1.13
10 9 估计的每g粪便中细菌数，E. coli 缺失= 7.0
10 8，C. sporogenes 缺失 = 1.3
10 9，B. fragilis 缺失 = 1.1
10 9，E. faecalis 缺失 = 8.9
10 8。在第16.1天，我们通过比较在缺失实验中每个剩余物种的密度，和其在完整集合中的密度来计算每个缺失物种的影响。如图3D所示，*每个缺失的物种对已知的集合具有不同的影响模式，这表明噬菌体对每个细菌物种的敲低都可以产生表型独特的结果。
图3 细菌缺失对模拟群落定殖的影响
Impact of Bacterial Dropouts on Colonization of Consortia
(A)概念解释：周围微生物群落的集群密度如何对细菌缺失群落中单个物种(物种1)的缺失做出反应的示意图。实线以箭头终止，表示假设的促进，虚线以正交线终止，表示假设的抑制。“完整集合（Full consortium）”，即左图，示意性地描述了细菌物种1、2和3的浓度。而“细菌敲低（Bacterial knockdown，中图）”和“细菌缺失（‘Bacterial dropout，右图）”设置描述了物种1减少和消除时，对物种2和物种3的影响。
(B)实验室示意图：为了确定细菌群落中细菌缺失的影响，使用含有九种细菌成员的细菌混合物，对四组五只单独饲养的无菌C57Bl/6小鼠灌胃，依次缺失E. coli, C. sporogenes, B. fragilis 和E. faecalis。
(C)完整（第1列）模拟群落或某种细菌缺失（第2-4列）群落的估计的总定殖密度显示在一个堆叠柱状图中，该图具有一个完整的上面板和一个放大的下面板，下面板显示低丰度物种。y轴以线性比例显示，每种细菌的浓度是从每组小鼠(n = 5)计算的几何平均值。
(D)在第16.1天，细菌缺失群落中每个细菌物种对数(log10)变换定殖差异倍数。每个条代表平均值 ± 标准差。
在某些情况下，噬菌体定向敲低（knockdown）可以具有接近细菌缺失的消减效果， 例如T4噬菌体，其在给药后立即显著减少E. coli 的数量。正如我们假设的相互作用网络所示(图4A)，E. coli 很可能通过细菌相互作用强烈促进B. fragilis 并强烈抑制B. vulgatus ，因此其被第一组噬菌体敲低（knockdown）可能导致B. fragilis 的减少和B. vulgatus 的扩张。这些影响的程度接近缺失研究中观察到的水平(图4C)，这可能是因为E. coli 是这些细菌物种的主要影响者。
图4 .肠道菌群中的细菌相互作用网络
Bacterial Interaction Network in the Gut Microbiota
将定殖期限（16.1天）延长之后，比较完整的十个细菌成员集合的定殖实验和被噬菌体靶向的细菌的缺失定殖实验的不同，而假设的因果相互作用网络。数据信息来源于图3D, 这里只是将数据可视化。
(A, B) 代表E. coli 与C. sporogenes (A) 和E. faecalis 与 B. fragilis (B)相互作用的网络。线宽对应于细菌缺失引起的定殖密度变化，即log10转化，实线以箭头终止，表示假设的促进，虚线以正交线终止，表示假设的抑制。
(C，D) 在施加第一组噬菌体(T4和F1），靶向E. coli 和C. sporogenes (C)和施加第二组噬菌体(B40-8和VD13），分别靶向B. fragilis 和E. faecalis (D)后的选定时间点(0.3天、2天和13天)，来自与完整集合定殖的小鼠的每种物种的浓度的log10变换值。条形代表平均值 ± 标准差。
当两个相反的效应作用于同一个物种时，因果效应就会变得模糊，不过仍然可以用相互作用网络来合理解释。 例如，在施用第二组针对E. faecalis 和B. fragilis 的噬菌体后，我们发现对周围微生物群落的定殖影响相对较小(图2C)。然而，我们针对第二组被噬菌体靶向的细菌物种的相互作用网络(图4B)表明A. muciniphila, B. ovatus, B. vulgatus, P. distasonis 和P. mirabilis 被B. fragilis 抑制，并且被E. faecalis 促进。因此， 施加第二组噬菌体会同时敲除这两种被噬菌体靶向的细菌物种，这可能会将抑制或者促进的效应抵消，导致它们对群落的个体效应无效，导致对整个细菌集合定殖的影响忽略不计。
我们还观察到由于噬菌体捕食产生的细菌时间动态的效应，这可以用细菌相互作用来解释。例如，我们观察到，尽管其他物种立即表现出反应，但P. distasonis 在噬菌体施加约3天后才开始了扩张(图2B)。如图4A所示，细菌相互作用暗示了这种行为的机制。在引入第一组噬菌体后不久，C. sporogenes 和E. coli 分别被噬菌体F1和T4敲低（knockdown）(图1B)，这导致它们各自失去了对P. distasonis 促进和抑制的效应。随着E. coli 的持续敲低，由于去抑制作用，P. distasonis 也经历了持久的扩张。然而，C. sporogenes 只经历了最初的短暂敲低，其在最初几天之后的恢复与P. distasonis 的促进相一致，因此，解释了P. distasonis 在第3天之后开始的第二次扩张。P. mirabilis 也观察到了类似的效果，不过程度较低，这是因为C. sporogenes 的促进作用较弱。
我们的结果还表明了一些更深层次的级联效应（cascading effects），不过在我们的交互网络中没有捕捉到。这些效应来自于缺失实验。如图4C所示，通过第一组噬菌体敲低（knockdown）E. coli 和C. sporogenes，导致A. muciniphila 的富集大大超过缺失实验所描述的。当我们的研究检查了细菌集合十个成员中的四个成员的因果效应时，A. muciniphila 很可能经历了来自微生物群落其他成员(例如，B. vulgatus, B. ovatus, P. distasonis和/或 P. mirabilis )的附加影响。
5 噬菌体调节细菌影响了肠道代谢组
Bacterial Modulation Induced by Phages Impacts the Gut Metabolome
我们试图通过肠道代谢组的变化来描述噬菌体捕食对微生物组的功能效应。 总的来说，我们的预期是，大多数代谢物的水平会降低，以应对由于我们定义的细菌集合中代谢冗余而引起的干扰，但是与我们集合中特定物种特有的微生物途径相关的化合物将对细菌组成的扰动敏感。使用非靶向代谢组学，我们研究了小鼠定殖不同阶段的粪便代谢物，即无菌、稳定的细菌定殖后、引入E. coli 和C. sporogenes 的噬菌体后，以及引入E. faecalis 和B. fragilis 的噬菌体后（图5A）。
总的来说，噬菌体引导的肠道微生物组的重建对代谢物的数量影响相对较小。 第一组噬菌体的施加导致17%的受检化合物发生统计学上显著的变化，但有趣的是这些代谢物代表了几乎所有的KEGG途径(例如，氨基酸、肽、碳水化合物、脂质、核苷酸、辅因子（cofactors）、维生素和异生物质（xenobiotics）)(图5B)。我们还发现，第二组噬菌体的在代谢产物数量方面的影响相对有限，因为只有0.7%的代谢物受到显著影响(图5C)，这与微生物群落相对有限的变化相一致，微生物群落的变化主要是施加噬菌体13天后E. faecalis 的减少(图5E)。相比之下，将细菌引入无菌小鼠后，粪便代谢组发生了广泛的变化，所有KEGG途径中总共860种代谢物中的60% (514种代谢物）增加了，15% (127种代谢物)减少了。综上所述，这些观察结果表明代谢组学受影响的广度反映了肠道微生物组中组分变化的程度。