【科普】Science |单细胞测序揭示mRNA新旧更替规律

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亮点：开发了一种“单细胞EU标记RNA测序”（scEU-seq）的新方法，来研究基因转录本的产生和降解是何如被调节的。

哺乳动物细胞中信使RNA水平调节可以通过调节合成和降解速率来实现。大量的代谢RNA标记实验已经使用相对均匀的细胞群量化了这些比率。然而，要在复杂的动力学过程中确定这些速率，例如在细胞分化过程中，尚不清楚。单细胞RNA测序的进展有助于解决这个问题。

近日，由来自荷兰乌德勒支干细胞与发育生物学研究所(Hubrecht Institute)的Alexandervan Oudenaarden等人在science杂志上发表了题为‘Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mRNA turnover strategies’的文章。研究者开发了一种方法，可以同时量化数千个细胞中代谢标记的和先前存在的未标记转录本。通过测定了细胞周期和肠干细胞分化过程中的合成和降解率，来揭示了主要的调控策略。这些策略对于控制基因表达的动态范围和精确性具有显著的效果。

单细胞RNA测序的进展有助于解决问题，但目前为止并没有如何动态控制转录和降解从而导致观察到的表达模式的方法。控制mRNA寿命的动力学参数可以通过转录过程中的代谢标记来测量。研究者证明用5-乙炔尿苷（EU）标记的mRNA可以通过测序在数千个单个细胞中检测到。通过测定不同种和非同步细胞群的转录和降解率，揭示人类细胞周期和小鼠肠干细胞分化过程中的mRNA控制策略。

为了测量单个细胞中新合成的转录本，通过用EU培养细胞来标记mRNA，将这种方法命名为“单细胞EU标记RNA测序”（scEU-seq）。与二甲基亚砜（DMSO）处理过的细胞或空对照相比，EU处理过的细胞中标记的mRNA的唯一分子标识符(UMI)计数更高，从而导致高信噪比和低污染率。

通过进行脉冲追踪实验来评估scEU-seq是否特异性地丰富EU标记窗口期间合成的转录本。检测到标记的UMI随着EU脉冲长度的增加而增加，随着尿苷（U）追踪长度的增加而减少。在这些短的EU脉冲中，发现未经标记内含子的转录本中富含标记的UMIs。

利用scEU-seq脉冲追踪实验的数据，可以估计所有检测到的转录本的合成速率κ和降解速率常数γ。将单个细胞放置在细胞周期或分化轨迹上，从而推断合成和降解率如何随时间变化。为了将κ和γ拟合到实验数据集，模拟了脉冲追踪实验的动力学，并量化了拟合过程的精度。模拟了κ和γ值的范围，可以精确地确定这些速率，并证明了不假设基因表达的稳态动力学的模型更适合数据集。

接下来，使用细胞周期进展估计来汇集来自不同EU标记时间点的细胞，并使用非稳态模型对528个在细胞周期中显示高表达变化的基因进行κ和γ拟合。发现在细胞周期中合成和降解速率都发生了广泛的变化。用自组织图（SOMs）对表达水平、合成速率和降解速率常数进行聚类分析，揭示了细胞周期中mRNA调控的不同策略。在进一步的模拟中，在整个细胞周期中改变了κ和γ的状态，验证了可以准确地确定大多数被测试的参数组合的策略类型。这些结果表明，具有相似细胞功能的基因往往受到相似策略的控制。

接下来，假设一个具有常数κ或γ的模型，来研究预测表达式的变化。选择这些常数来匹配实验数据中观察到的整个细胞周期的平均表达式。该模型假设动态κ和γ可以准确地预测CEL-seq2数据集的动态范围和表达时间。结果意味着降解和合成速率是协调的，以实现细胞周期中精确的表达动力学。

为了研究scEU-seq是否能揭示细胞分化过程中类似的mRNA调控策略，在肠干细胞中进行脉冲实验。再计算了选择的基因在整个分化过程中的合成速率和降解速率常数之后，使用SOMs根据基因的表达水平、合成速率和降解速率常数对基因进行聚类。结果表明，细胞在分化过程中利用合成率和降解率共同控制基因的表达。24%的基因（72个基因）在分化过程中降解速率发生变化，而合成速率增加，表现出协同和不稳定的策略。

总之，研究证明了细胞在细胞周期和分化过程中使用策略来主动调节基因表达，合成和降解率控制动态基因表达的准确性和精确性以及表达高峰的时间。相反，在分化过程中，降解速率似乎只影响表达的动态范围，而时间完全由mRNA合成速率动态编码。因此，数据发现，mRNA降解率的调节在哺乳动物细胞内稳态和哺乳动物胚胎干细胞分化中发挥作用。

Alexander van Oudenaarden，是Hubrecht Institute的组长，乌得勒支大学医学中心和乌得勒支大学的基因调控定量生物学教授。是单细胞RNA测序的先驱之一，他的实验室已开发出多种生物信息学工具来详细分析这些数据。主要兴趣是研究具有相同基因型和相同生长环境的细胞发展不同表型的机制。Van Oudenaarden小组将生物学与物理学和信息学相结合，以洞悉发育和干细胞的定量生物学。他们开发了量化基因表达并研究单细胞中基因表达调控的新技术。

参考文献

1. Nico Battich, Joep Beumer, Buys de Barbanson. et al. Sequencing metabolically labeled transcripts in single cellsreveals mRNA turnover strategies. Science 06 Mar 2020:Vol. 367,Issue 6482, pp. 1151-1156.