Un1Cas12f1 (Cas14a1) Nuclease

■ 产品概述

产品描述

Un1Cas12f1(又名Cas14a1)是依赖于crRNA和tracrRNA共同介导的(或融合后的sgRNA单独介导的)DNA核酸内切酶，能特异结合并切割靶标ssDNA，且不受PAM位点的限制。此外，Un1Cas12f1也能以PAM依赖的方式特异地剪切靶标dsDNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。与其他Cas12蛋白类似，Un1Cas12f1蛋白同样拥有针对ssDNA的反式切割活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，双链或单链DNA靶标均能激活Un1Cas12f1的反式剪切活性，即当Un1Cas12f1蛋白与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列ssDNA的反式剪切活性，将体系中的任意序列ssDNA切碎。
相比于其他的Cas蛋白，Cas12f1蛋白的分子量普遍较小(400~700AA)，其中Un1Cas12f1的分子量约61.5 kD，可用于靶标核酸的分子检测(详细信息请参考PMID: 30337455)。

 

产品优势

✽ 标准化定义的反式剪切活性：在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内切割1 pmol ssDNA探针所需的Cas12f酶量定义为1 transU。本公司提供的Cas酶transU数值可于COA检测报告中查询。

 

实验案例

1.1.Un1Cas12f1的反式剪切：本实验中使用3种ssDNA靶标序列，分别命名为Target ssDNA1，Target ssDNA2，Target ssDNA3，并针对不同靶标序列设计了对应的sgRNA。同时，在剪切反应体系中加入ssDNA报告探针,该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。实验结果表明，当Un1Cas12f1在对应sgRNA引导下与特异靶标ssDNA形成三元复合物后，便会被激活针对ssDNA的高效反式剪切活性，将体系中的ssDNA报告探针切碎，从而发出荧光信号。

图1:不同ssDNA靶标存在下Un1Cas14a1反式剪切的结果。
Fig 1. Results of Un1Cas14a1 collateral cleavage in the presence of different target ssDNA.

 

实验流程

1.顺式切割实验

组分	体积	终浓度
10 × HOLMES Buffer 1	2 μL	1 ×
10 µM Un1Cas12f1 Nuclease	0.05~0.5 μL	25~250 nM
10 µM sgRNA	0.05~0.5 μL	25~250 nM
10 µM Target DNA	0.05~0.5 μL	25~250 nM
10 µM ssDNA Reporter	0.05~0.5 μL	25~250 nM
Nuclease-free water	Up to 20 μL

◆ 顺式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
◆ 若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被反式激活的Cas12b进一步切碎。对于20 μL顺式剪切应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和sgRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。
◆ 60℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。

 

2.反式剪切实验

组分	体积	终浓度
10 × HOLMES Buffer 1	2 μL	1 ×
10 μM Un1Cas12f1 Nuclease	0.05~0.5 μL	25~250 nM
10 μM sgRNA	0.05~0.5 μL	25~250 nM
1 μM Target DNA	0.5~5 μL	25~250 nM
10 μM ssDNA Reporter	0.05~0.5 μL	25~250 nM
Nuclease-free water	Up to 20 μL

◆ 反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
◆ 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，AapCas12b Nuclease可用1×HOLMES Buffer1稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），sgRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
◆ 反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas酶transU的具体数值，详见本公司提供的COA检测报告。
◆ 实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，60℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。

 

产品组分

组分	32119-01 (100 pmol)	32119-03 (1,000 pmol)
● Un1Cas12f1 Nuclease (10 μM) a	100 pmol	1,000 pmol
● 10 × HOLMES Buffer 1	1 mL	1 mL
● Control Target ssDNA and sgRNA (10 μM) b	5 μL	5 μL
● ssDNA Reporter (FAM-BHQ1, 10 μM) c	5 μL	5 μL

a.Un1Cas12f1 Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；

b.Control Target ssDNA and sgRNA应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系；

c.ssDNA Reporter (FAM-BHQ1)应避光保存，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系。

 

保存条件

Control Target ssDNA and sgRNA于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。

 

■ 常见问题解答

Q1: 常见的Cas12f酶有哪些？它们和Cas12a、Cas12b家族有什么区别？

A1: 除了研究最多的Un1Cas12f1，还有Un2Cas12f1、PtCas12f1、AsCas12f1、RuCas12f1、SpCas12f1、CnCas12f1、Mi1Cas12f2、Mi2Cas12f2、AuCas12f2等，这些Cas12f均识别富含T的PAM序列。总的来说，Cas12f蛋白仅有400-700个氨基酸(aa)，大约是之前已知的Class II CRISPR-Cas酶(950-1400 aa)的一半大小。Cas12f需要crRNA和tracrRNA共同引导(或融合后的sgRNA单独引导)，一开始Jennifer Doudna团队的研究表明，Un1Cas12f1只能识别和切割ssDNA靶标(详细信息请参考PMID: 30337455)；然而Virginijus Siksnys团队的研究成果则证明，Un1Cas12f1同样具有PAM依赖型dsDNA靶标的识别和切割能力，且不同Cas12f的PAM序列稍有不同，但均富含T(详细信息请参考PMID: 32246713)。此外，dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Cas12f的反式剪切活性，可非特异性剪切体系中的ssDNA探针。详细对比如下表：

	Cas12a(Cpf1)	Cas12b (C2c1)	Cas12f (Cas14)
Classification	Class II Type V	Class II Type V	Class II Type V
Nuclease Domains	RuvC only	RuvC only	RuvC only
Guide RNA	crRNA only	crRNA and tracrRNA	crRNA and tracrRNA
PAM Sequence	5´-TTTN-3´ or 5´-TTN-3´	5´-TTN-3´	T-Rich
Cis-Cleavage Target	dsDNA with PAM or ssDNA	dsDNA with PAM or ssDNA	dsDNA with PAM or ssDNA
Cis-Cleavage Site of dsDNA	~14/18-23 bp 3´ of the PAM	~17-24 bp 3´ of the PAM	~20-24 bp 3’ of the PAM
Cis-Cleavage Site of ssDNA	~22 nt from the first 3´ guide-complementary base	/	beyond the guide-complementary region
Termini of Cis-Cleavage Products	5´ overhang	5´ overhang	5´ overhang
Trans-Cleavage  Target	ssDNA	ssDNA	ssDNA

 

Q2: 如何设计Un1Cas12f1的sgRNA？

A2: Un1Cas12f1的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGCACAAGAAAGUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGAAUGCAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（黑色代表tracrRNA区，灰色代表linker区，蓝色代表crRNA区，字体加粗标示tracrRNA的anti-repeat区和crRNA的repeat区；蓝色下划线表示crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为20～25 nt)。

 

Q3: Un1Cas12f1对反应环境有什么要求？

A3: Un1Cas12f1的剪切反应体系依赖Mg2+，在37～50℃范围内均有剪切活性。已有研究表明Cas12f 1需要低盐浓度(5～25 mM)的环境，在100～150 mM NaCl反应体系中没有高效的剪切活性。

 

Q4: 从结构角度上来说，Un1Cas12f1有什么特点？

A4: 已有研究从结构角度剖析Cas12f蛋白的作用过程和机制，值得注意的有两点：1)是Cas12f以二聚体的形式工作，即两个Cas12f结合同1个sgRNA；2)是从结构的角度Cas12f蛋白与核酸链的结合能力较弱。

 

Q5: Un1Cas12f1对单链DNA靶标的剪切位点在哪里？

A5: Un1Cas12f1对单链DNA靶标的剪切位点超出了与crRNA互补配对的区域，大约在距第一个与 crRNA引导序列配对的3'-碱基的第22位附近(21st-23th)。

 

Q6: Un1Cas12f1对双链DNA靶标的剪切位点在哪里？取决于什么？

A6: Cas12f家族都识别富含T的PAM序列，但不同来源的Cas12f识别的PAM序列稍有区别，例如Un1Cas12f1识别5′-TTTN-3′, 且对双链DNA靶标的剪切位点取决于PAM序列；对质粒dsDNA靶标的剪切位点在非靶标链(NTS)距PAM第20～22位，和靶标链(TS)距PAM第24位附近，交错剪切，并产生5′悬垂。

 

Q7: dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Un1Cas12f1的反式剪切活性吗？

A7: 是的，dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Un1Cas12f1的反式剪切活性。

 

Q8: 本试剂盒中的Control Target ssDNA and sgRNA既可用于顺式剪切体系的对照，又可用于反式剪切体系的对照吗？

A8: 不是，Un1Cas12f1试剂盒中提供的Control Target ssDNA and sgRNA仅可用于反式剪切。