AapCas12b (C2c1) Nuclease
■ 产品概述
产品描述
AapCas12b(又名C2c1)是依赖于crRNA和tracrRNA共同介导的(或融合后的sgRNA单独介导的)DNA核酸内切酶，来源于嗜酸耐热菌Alicyclobacillus acidophilus，是由tracrRNA:crRNA(或sgRNA)介导的DNA核酸内切酶，在靶标双链DNA存在PAM (TTN) 序列的情况下，剪切反应温度可达60～65℃。在靶标双链DNA存在PAM(5’-TTN-3’)的情况下，可特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。而AapCas12b特异地剪切单链DNA靶标不依赖PAM序列。此外，双链或单链DNA靶标均能激活AapCas12b的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，即当AapCas12b酶与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列ssDNA的反式剪切活性，可无差别地剪切反应体系中任意序列的ssDNA。AapCas12b比AacCas12b (#32116)更耐高温。因此，也更适用于与LAMP联用，开发“一管法”恒温扩增/CRISPR-Cas检测体系(详细信息请参考PMID: 32937062)。
产品优势
✽ 标准化定义的反式剪切活性：在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反应体系中，48℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssDNA探针所需的Cas12b酶量定义为1 transU。本公司提供的Cas酶transU数值可于COA检测报告中查询。
实验案例
1.AapCas12b的顺式剪切：本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标，靶标双链DNA总长度为2.2 kb，实验中设计的sgRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。实验结果表明，AapCas12b在sgRNA的引导下特异识别并剪切DNMT1序列，导致靶标DNA双链断裂，得到2段顺式剪切产物，片段大小分别为1.3 kb和900 bp。
图1: AapCas12b的顺式剪切活性
2.AapCas12b的反式剪切：本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标dsDNA，实验中设计的sgRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。同时，在剪切反应体系中加入ssDNA报告探针,该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。实验结果表明，当AapCas12b在sgRNA引导下与特异靶标dsDNA形成三元复合物后，便会被激活针对ssDNA的高效反式剪切活性，将体系中的ssDNA报告探针切碎，从而发出荧光信号。
图1:AapCas12b的反式剪切活性
实验流程
1.顺式剪切实验
组分 | 体积 | 终浓度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AapCas12b Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
10 μM sgRNA | 0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNA | 0.5 μL | 25 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
◆ 顺式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
◆ 若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被反式激活的Cas12b进一步切碎。对于20 μL顺式剪切应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和sgRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。
◆ 60℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。
2.反式剪切实验
组分 | 体积 | 终浓度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AapCas12b Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 μM sgRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
1 μM Target DNA | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
◆ 反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
◆ 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，AapCas12b Nuclease可用1×HOLMES Buffer1稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），sgRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
◆ 反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas酶transU的具体数值，详见本公司提供的COA检测报告。
◆ 实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，60℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
产品组分
组分 | 32118-01 (100 pmol) | 32118-03 (1,000 pmol) |
| 100 pmol | 1,000 pmol |
| 1 mL | 1 mL |
| 5 μL | 5 μL |
a.AapCas12b Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
b.Control Target DNA and sgRNA应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系。
保存条件
Control Target DNA and sgRNA于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。
■ 常见问题解答
Q1: 常见的Cas12b酶有哪些？它们和Cas12a家族有什么区别？
A1: Cas12b家族通常都比Cas12a家族更加耐热，常见的AacCas12b可在37°C～55°C温度范围内工作，最适温度为48°C；而AapCas12b相对AacCasb更加耐热，可在37°C～65°C温度范围内发挥剪切功能。因此，AapCas12b更适合与LAMP (60°C～65°C)联用。
Q2: 如何设计AapCas12b的sgRNA？
A2: AapCas12b的位点不包含CRISPR阵列，因此无法确定其原本的crRNA和tracrRNA序列。但已有研究证明，AapCas12b与AacCas12b具有95%的序列同源性，且AapCas12b能与AacCas12b的sgRNA结合并产生高效的核酸酶活性。AapCas12b的sgRNA可参照以下序列设计：
5′– GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGG
CAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。
Q3: 顺式剪切体系中Cas12b酶:sgRNA:target DNA的比例应如何调节？
A3: 为了使靶标dsDNA被剪切完全，常规建议Cas12b酶:sgRNA:target DNA=10:10:1。当sgRNA利用效率不高时，建议尝试Cas12b酶:sgRNA=1:1.25～2，太过量的sgRNA也不利于Cas12b的剪切。同时，sgRNA如果是转录制备的，需要注意转录产物的纯度。
Q4: AapCas12b对双链DNA靶标的剪切位点在哪里？取决于什么？
A3: Cas12b家族都识别富含T的PAM序列(5′-TTN-3′), 且对双链DNA靶标的剪切位点取决于PAM序列。以AacCas12b为例，其剪切位点在非靶标链(NTS)距PAM第17位附近，和靶标链(TS)距PAM第24位附近，交错剪切，并产生7 nt的5′悬垂。
Q5: dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活AapCas12b的反式剪切活性吗？哪种效率更高？
A5: dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活AapCas12b的反式剪切活性，这点与Cas12a相同。但不同的是，ssDNA靶标激发Cas12b反式活性的效率高于dsDNA靶标；而dsDNA靶标激发Cas12a反式活性的效率高于ssDNA靶标。
Q6: AapCas12b的反式剪切有序列偏好性吗？
A6: 有文献报道Cas12b剪切PolyA，PolyT，PolyC的效率高于PolyG，说明Cas12b蛋白对ssDNA底物的反式剪切效率也是受到ssDNA序列影响的，具体的偏好性需要实验验证。
Q7: 本试剂盒中的Control Target DNA and sgRNA既可用于顺式剪切体系的对照，又可用于反式剪切体系的对照吗？
A7: 是的，AapCas12b试剂盒中提供的Control Target DNA and sgRNA可用于顺式剪切或反式剪切。