LwaCas13a (C2c2) Nuclease
■ 产品概述
产品描述
LwaCas13a(又名C2c2)是依赖于crRNA单独介导的RNA内切核酸酶，来源于Leptotrichia wadei菌株。可特异地识别并剪切靶标单链RNA，且对PFS序列的要求并不严格。此外，Cas13a也具有反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，即当LwaCas13a蛋白与crRNA、靶标RNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列单链RNA的反式剪切活性，将体系中的任意序列单链RNA切碎。该活性也被用于靶标核酸的快速检测试剂盒的开发。例如，Broad研究所的张锋团队便利用Cas13a蛋白开发了名为“SHERLOCK”的下一代分子诊断系统(详细信息请参考PMID: 28408723) 。
产品优势
✽ 标准化定义的反式剪切活性：在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer 2 [pH 7.6]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssRNA探针所需的Cas13a酶量定义为1 transU。本公司提供的Cas酶transU数值可于COA检测报告中查询。
实验案例
1.LwaCas13a的反式剪切：本实验中包含LwaCas13a、crRNA，以及不同浓度梯度的target RNA，并在剪切反应体系中加入等量的ssRNA报告探针,该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。实验结果表明，LwaCas13a在crRNA引导下与特异靶标ssRNA形成三元复合物后，便会被激活针对ssRNA的反式剪切活性，剪切体系中的ssRNA报告探针并发出荧光信号。靶标RNA浓度越高，体系反式剪切ssRNA报告探针的速度更快，释放的荧光信号到达平台期的时间越短。
图1:不同浓度梯度ssRNA靶标存在下LwaCas13a的反式剪切结果。
Fig 1. Results of LwaCas13a collateral cleavage under different concentration of target ssRNA.
实验流程
1.反式切割实验
组分 | 体积 | 终浓度 |
10 × HOLMES Buffer 2 | 2 μL | 1 × |
10 µM LwaCas13a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM crRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM Target RNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM ssRNA Reporter (FAM-BHQ1) | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
◆ 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，LwaCas13a Nuclease可用1×HOLMES Buffer 2稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas13酶长期保存，请使用Cas13 Dilution Buffer，#32013），crRNA、Target RNA及ssRNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target RNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
◆ 反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas酶 transU的具体数值，详见本公司提供的COA检测报告。
实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
产品组分
组分 | 32117-01 (100 pmol) | 32117-03 (1,000 pmol) |
| 100 pmol | 1,000 pmol |
| 1 mL | 1 mL |
| 5 μL | 5 μL |
| 5 μL | 5 μL |
a.LwaCas13a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
b.Control Target RNA and crRNA应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系；
c.ssRNA Reporter(FAM-BHQ1)应避光保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系。
保存条件
Control Target RNA and crRNA以及 ssRNA Reporter(FAM-BHQ1)于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。
■ 常见问题解答
Q1: 常见的Cas13酶有哪些？它们和Cas12、Cas9家族有什么区别？
A1: 常见的Cas13包括Cas13a、Cas13b、Cas13c等，其中Cas13a/Cas13c的spacer区在crRNA的3'端，例如LwaCas13a；而Cas13b的spacer区在crRNA的5'端，例如PsmCas13b。总的来说，Cas13蛋白只需要crRNA单独引导，识别并剪切靶标ssRNA。此外，ssRNA靶标能激活Cas13的反式剪切活性，可非特异性剪切体系中的ssRNA探针。详细对比如下表：
Cas9 | Cas12 | Cas13 | |
Classification | Class II Type II | Class II Type V | Class II Type VI |
Nuclease Domains | RuvC and HNH | RuvC only | HEPN × 2 |
Guide RNA | crRNA and tracrRNA | crRNA only or | crRNA only |
PAM Sequence | 5´-NGG-3´ | T-Rich | / |
Cis-Cleavage Target | dsDNA with PAM | dsDNA with PAM or ssDNA | ssRNA |
Trans-Cleavage Target | / | ssDNA | ssRNA |
Q2: 如何设计LwaCas13a的crRNA？
A2: LwaCas13a的crRNA可参照以下序列设计：
5′–GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（黑色代表direct repeat区，蓝色下划线标示crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为28 nt)。
产品组分
组分 | 32117-01 (100 pmol) | 32117-03 (1,000 pmol) |
| 100 pmol | 1,000 pmol |
| 1 mL | 1 mL |
| 5 μL | 5 μL |
| 5 μL | 5 μL |
a.LwaCas13a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
b.Control Target RNA and crRNA应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系；
c.ssRNA Reporter(FAM-BHQ1)应避光保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系。