AsCas12a (Cpf1) Nuclease
■产品概述
产品描述
AsCas12a(又名AsCpf1)一种由crRNA单独引导的DNA核酸内切酶，来源于Acidaminococcus sp. BV3L6菌株。在靶标双链DNA存在PAM (TTTV，V=A/C/G)序列的情况下，AsCas12a可特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。而AsCas12a特异地剪切单链DNA靶标不依赖PAM序列。此外，双链或单链DNA靶标均能激活AsCas12a的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，即当AsCas12a酶与crRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列ssDNA的反式剪切活性，将体系中的任意序列ssDNA切碎。因此，AsCas12a酶不仅可用于体外dsDNA的特异剪切，也可用于靶标核酸的快速检测，详见本公司开发的HOLMES[1]核酸快检技术。
产品优势
✽ 标准化定义的反式剪切活性：在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssDNA探针所需的Cas12a酶量定义为1 transU。本公司提供的Cas酶transU数值可于COA检测报告中查询。
实验案例
1.AsCas12a的顺式剪切：本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标，靶标双链DNA总长度为825 bp，实验中设计的crRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。实验结果表明，AsCas12a在crRNA的引导下特异识别并剪切DNMT1序列，导致靶标DNA双链断裂，得到2段顺式剪切产物，片段大小分别为525 bp和300 bp。
图1:AsCas12a的顺式剪切活性
2.AsCas12a的反式剪切：本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标dsDNA，实验中设计的crRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。同时，在剪切反应体系中加入ssDNA报告探针,该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。实验结果表明，当AsCas12a在crRNA引导下与特异靶标dsDNA形成三元复合物后，便会被激活针对ssDNA的高效反式剪切活性，将体系中的ssDNA报告探针切碎，从而发出荧光信号。
图2:AsCas12a的反式剪切活性
实验流程
1.顺式剪切实验
组分 | 体积 | 终浓度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AsCas12a Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
10 μM crRNA | 0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNA | 0.5 μL | 25 nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
◆ 顺式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
◆ 若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被反式激活的Cas12a进一步切碎。对于20 μL顺式剪切应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。
37℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。
2. 反式剪切实验
组分 | 体积 | 终浓度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AsCas12a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 μM crRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
1 μM Target DNA | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，FnCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer 1稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas酶transU的具体数值，详见本公司提供的COA检测报告！
实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
产品组分
组分 | 32106-01 (100 pmol) | 32106-03 (1,000 pmol) |
| 100 pmol | 1,000 pmol |
| 1 mL | 1 mL |
| 5 μL | 5 μL |
a.FnCas12a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
b.Control Target DNA and crRNA应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系。
保存条件
Control Target DNA and crRNA于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。
■ 常见问题解答
Q1: Cas12a与Cas9有什么区别？
A1: 总的来说，Cas9需要crRNA和tracrRNA共同引导(或融合后的sgRNA单独引导)，特异性识别并剪切带PAM（5´-NGG-3´）的dsDNA靶标，不具有反式剪切活性；而Cas12a只需要crRNA单独引导，特异性识别并剪切带PAM（5´TTTN-3´ or 5´TTN-3´）的dsDNA靶标，对ssDNA靶标的识别和剪切不依赖PAM序列，且dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性，可非特异性剪切体系中的ssDNA。详细对比如下表：
Cas9 | Cas12a (Cpf1) | |
Classification | Class II Type II | Class II Type V |
Nuclease Domains | RuvC and HNH | RuvC only |
Guide RNA | crRNA and tracrRNA | crRNA only |
PAM Sequence | 5´-NGG-3´ | 5´TTTN-3´ or 5´TTN-3´ |
Cis-Cleavage Target | dsDNA with PAM | dsDNA with PAM or ssDNA |
Cis-Cleavage Site | 3 bases 5´ of the PAM | ~18 bases 3´ of the PAM |
Termini of Cis-Cleavage Products | Blunt ends | 5´ overhang |
Trans-Cleavage Target | / | ssDNA |
Q2: AsCas12a的crRNA应该如何设计？
A2: AsCas12a的crRNA包含全长19 nt的直接重复序列(DR区，又名scaffold区)，以及长度为20 nt的引导序列(spacer区)。AsCas12a的crRNA可参照以下序列设计：
5′– AAUUUCUACUCUUGUAGAUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。
Q3: 不同来源的Cas12a对PAM区识别有差异吗？
A3: Cas12a家族都识别富含T的PAM序列，其中FnCas12a、MbCas12a等识别5′-TTN-3′；AsCas12a、LbCas12a、Lb2Cas12a等识别5′-TTTN-3′。
Q4: 除了AsCas12a，其它常见的Cas12a酶还有哪些？它们的crRNA的直接重复序列（又名DR区或Scaffold区）序列有什么不同？
A4: 常见的Cas12a酶包括FnCas12a、LbCas12a、AsCas12a等，Cas12a家族crRNA的直接重复序列都高度保守，详见下表（下表中crRNA的5’端第一位碱基会被Cas12a处理掉，因此设计crRNA时可忽略）：
Q5: 顺式剪切体系中Cas12a酶:crRNA:target DNA的比例应如何调节？
A5: 为了使靶标dsDNA被剪切完全，常规建议Cas12a酶:crRNA:target DNA=10:10:1。当crRNA利用效率不高时，建议尝试Cas12a酶:crRNA=1:1.25～2。
Q6: dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性吗？哪种效率更高？
A6: 双链DNA靶标和单链DNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性(trans-cleavage，又名collateral cleavage)，这点与Cas12b相同。但不同的是，ssDNA靶标激发Cas12b反式活性的效率高于dsDNA靶标；而dsDNA靶标激发Cas12a反式活性的效率高于ssDNA靶标。
Q7: Cas12a对dsDNA靶标和ssDNA靶标的剪切位点取决于什么，具体在哪里？
A7: Cas12a对靶标双链DNA的剪切位点主要取决于PAM，原有研究显示，Cas12a在非靶标链(NTS)距PAM第18位和靶标链(TS)距PAM第23位进行剪切，从而形成5'端5-nt悬垂的粘性末端。但实际上，该剪切位点并不是非常专一，受到不同来源Cas12a、不同靶标序列以及不同长度crRNA的影响。具体来说，非靶标链距PAM 的第14位附近(12th-15th)和第18位附近(18th-20th)均有剪切，靶标链距PAM的第22位附近(21st-24th)发生剪切。Cas12a家族对靶标单链DNA的剪切不依赖PAM序列，剪切位点距第一个与 crRNA引导序列配对的3'-碱基的第22位附近(21st-23th)。
Q8: 本试剂盒中的Control Target DNA and crRNA既可用于顺式剪切体系的对照，又可用于反式剪切体系的对照吗？
A8: 是的，AsCas12a试剂盒中提供的Control Target DNA and crRNA可用于顺式剪切或反式剪切。
组分 | 32104-01 (100 pmol) | 32104-03 (1,000 pmol) |
| 100 pmol | 1,000 pmol |
| 1 mL | 1 mL |
| 5 μL | 5 μL |