Sp-dCas9 Nuclease
■产品概述
产品描述
SpCas9是一种由crRNA和tracrRNA共同(或两者融合后形成的sgRNA)引导的DNA内切核酸酶，来源于S. pyogenes菌株。在靶标双链DNA存在PAM(5′-NGG-3′)的情况下，特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成平末端。PAM对于Cas9的识别和剪切都是必需的，其剪切位点位于目标序列(target sequence)内，离PAM区3个碱基。SpCas9酶的HNH和RuvC结构域分别负责切割靶标双链DNA中与sgRNA配对和非配对的链。本产品中，SpCas9的H840和D10都被突变为A，从而使其HNH和RuvC功能域失活，获得了Sp-dCas9酶。因此，Sp-dCas9只有结合靶标DNA的活性，而没有切割靶标DNA的活性。
产品优势
✽ 高纯度
✽ 高灵敏度
✽ 高特异性
实验案例
Sp-dCas9与靶标DNA的结合实验：为了验证Sp-dCas9与target DNA的结合，我们通过5’端带FAM基团的引物在全长59 bp的target dsDNA扩增产物末端引入FAM标记。然后将target dsDNA-FAM与对应的sgRNA、Sp-dCas9 Nuclease加入结合反应体系，在37℃静置孵育30 min。最后，用2%的琼脂糖凝胶低温电泳(100 V，60 min)，在化学发光成像分析仪(GE ImageQuantLAS4000)上用荧光通道检测样本条带。实验结果表明，Sp-dCas9 + sgRNA + target dsDNA-FAM泳道电泳跑胶迁移速率较慢，说明Sp-dCas9在sgRNA的引导下特异地识别并结合了target dsDNA。此外，还可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)对Sp-dCas9与target DNA的结合进行检测。
图1:Sp-dCas9在sgRNA的引导下特异地识别并结合target dsDNA。
实验流程
1. Sp-dCas9与靶标DNA结合实验
组分 | 体积 | 终浓度 |
10 × TOLO Buffer 3 | 2 μL | 1 × |
10 μM Sp-dCas9 Nuclease | 1.5 μL | 750 nM |
10 μM sgRNA | 1.5 μL | 750 nM |
1 μM Substrate DNA | 3 μL | 150 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
37℃反应30 min，可通过非变性核酸电泳对实验结果进行检测。
产品组分
组分 | 32102-01 (100 pmol) | 32102-03 (1,000 pmol) |
| 100 pmol | 1,000 pmol |
| 1 mL | 1 mL |
a.Sp-dCas9 Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
保存条件
-20℃储存；≤ 0℃运输。
■ 常见问题解答
Q1: dCas9与Cas9有什么区别？
A1: Cas9可识别并剪切dsDNA靶标，其机制涉及HNH和RuvC两个结构域，HNH剪切TS链，RuvC剪切NTS链，两者共同产生dsDNA双链断裂(DSBs)，产生平末端。但dCas9由于H840A和D10A氨基酸突变，导致HNH和RuvC结构域失活，只能结合靶标dsDNA，而不能切割靶标dsDNA。此外，还有nCas9，由于D10A突变导致RuvC结构域失活，nCas9结合dsDNA后只能剪切其中的一条链形成切口。
Q2: Sp-dCas9的sgRNA应该如何设计？
A2: Sp-dCas9的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。